NucleicAcidsResCAR

作者：王晓蔷张佳慧宁含含

SMA（Autosomal-recessiveproximalspinalmuscularatrophy）由SMN1disruption所致。SMN存在第二个拷贝本，但存在C-T转化而影响SMN蛋白稳定性。SMA患者体内全长SMN蛋白水平足以维持所有细胞发育和生长，但运动神经元例外。SMN与Gemins2-8和unrip紧密相连形成~50S大分子复合物，促进胞质内Sm蛋白和UsnRNAs有效形成snRNPs，介导pre-mRNA剪切。许多研究表明，SMA组织存在UsnRNAs低水平和广泛剪接缺陷。SMN在运动神经元轴突附近与RNAgranules（轴突和树突内特异性运输mRNAs）共定位，且与许多RNAbindingproteins相连。本研究“CARM1促进NMD而诱发脊髓肌萎缩”探究了CARM1在SMA中作用及机制。

首先团队评估已有SMA研究的genome-widegeneexpressionprofiles发现均USPL1（编码SUMOisopeptidase）misregulated，与USPL1E2-相比，USPL1E2+（Exon2存在的剪接体）在SMA内水平更高。之前本团队研究发现CARM1水平在SMA小鼠模型和患者细胞内上调。而后，敲低或过表达CARM1可下调或上调E2+/E2-比率，回补CARM1突变体（EQ）可降低比例。因此，CARM1依靠其甲基化活性调控Uspl1E2+/E2-比例。

进一步观察到，skippingExon2造成编码阅读框的移位且产生PTC（外显子连接处上游50-55nt处），从而发生NMD。CHX可降低E2+/E2-，提示E2-在翻译依赖性NMD活性降低时更稳定。敲低UPF1(NMD过程中重要作用分子)可降低E2+/E2-。wortmannin（NMD抑制剂）处理也可降低E2+/E2-。ActinomycinD处理后，E2-转录本更短。因此，Uspl1E2-被NMD负向调控。敲低CARM1后，可增加Uspl1E2-mRNA半衰期。因此CARM1可调控Uspl1可变剪接过程，在一定程度上可通过NMD调控其mRNA稳定。

为进一步探究CARM1对NMD作用机制，该团队建立了NMDreporter系统（β-globinpre-mRNA-Exon2突变或野生型-包含PTC），发现PTC-NMD过程需CARM1，且不依赖其甲基转移酶活性，但NMDfactors在敲低CARM1后并无明显变化。

接着使用内源性IP证实CARM1与UPF1相互作用，而后使用RNaseA处理发现，与UPF1结合的CARM1更少。RIP结果发现，敲低CARM1可降低UPF1-bindingβ-globinMTreportermRNAs。因此CARM1促进NMD，部分通过加强UPF1与PTC-containingmRNA结合作用。

使用已知的NMDtargets（有PTC-可变剪接后可插入或去除外显子、上游有ORF、3‘UTR区有内含子）发现，三个NMD转录本对CARM1敏感，半定量qPCR结果发现，敲除CARM1使得containing-PTC的Sfrs10isoform的exoninclusion增加的更多（比skipped），转录总水平不变。使用CARM1-/-小鼠的MEFs细胞发现，内源性NMDtargets更稳定。

最后使用SMN+/-小鼠模拟mildSMA和SMA患者细胞证实以上猜想。

预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇